在真核細(xì)胞中，有著多種不同的分子途徑來(lái)確保細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、以及線粒體中的蛋白質(zhì)有正常的折疊完整性，這些分子信號(hào)能夠以特定的方式去感知未折疊蛋白的存在并向細(xì)胞核內(nèi)發(fā)出信號(hào)，以此來(lái)激活那些可以調(diào)控未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的基因的表達(dá)，這一分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)有著十分重要的意義。線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（mitochondrial unfolded protein response, mtUPR）是指線粒體為了維持其蛋白質(zhì)平衡，啟動(dòng)由DNA 編碼的線粒體熱休克蛋白和蛋白酶等基因群轉(zhuǎn)錄活化程序的應(yīng)激反應(yīng)。近幾年來(lái)，mtUPR也逐漸進(jìn)入研究者的視線，被認(rèn)為是線粒體質(zhì)量調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一。由蛋白酶 ClpP 以及它的復(fù)合體 ClpX 調(diào)控的 mtUPR的過(guò)程在普通真核細(xì)胞中已有研究報(bào)道，然而這一對(duì)復(fù)合體蛋白在生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的作用以及分子機(jī)制還存在大量未知。
2023年10月5日，香港大學(xué)深圳醫(yī)院，生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王天任課題組在Communications Biology上在線發(fā)表了題為”ClpP/ClpX deficiency impairs mitochondrial functions and mTORC1 signaling during spermatogenesis”的研究。該研究通過(guò)分別構(gòu)建ClpP和ClpX的條件性敲除小鼠模型，在小鼠的生殖細(xì)胞中分別敲除ClpP和ClpX后，發(fā)現(xiàn)雄性小鼠的睪丸組織均顯著減小，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)劇烈改變，生殖細(xì)胞因線粒體形態(tài)及功能發(fā)生紊亂從而發(fā)生大規(guī)模凋亡，造成細(xì)胞數(shù)量大規(guī)模丟失。不難猜想，這些cKO小鼠的生殖細(xì)胞無(wú)法順利進(jìn)行減數(shù)分裂，最終導(dǎo)致精子生成障礙。
通過(guò)切片和免疫熒光染色，能夠觀察到在這一時(shí)期的睪丸組織中，對(duì)照組的小鼠已經(jīng)可以觀察到比較后期的圓形精子細(xì)胞，甚至可以通過(guò)DAPI染色觀察到有條形精子的出現(xiàn)，然而在ClpP或ClpX敲除的小鼠組織中，生殖細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯在了減一前期，減數(shù)分裂的細(xì)胞不能成功進(jìn)入到粗線期（Pachytene），表現(xiàn)為γH2A.X信號(hào)仍然殘留在全部的常染色體中，而沒(méi)有聚集在XY性染色體。
通過(guò)進(jìn)一步染色體鋪片的方式去做免疫熒光染色分析，發(fā)現(xiàn)Clpp或者Clpx基因缺失的精母細(xì)胞，不能成功從zygotene時(shí)期進(jìn)入到pachytene時(shí)期，表現(xiàn)為DNA雙鏈破裂信號(hào)在pachytene時(shí)期錯(cuò)誤分布，常染色體聯(lián)會(huì)不完全，以及cross-over沒(méi)有正常進(jìn)行（表現(xiàn)為MLH1信號(hào)在pachytene中后期還未有染色體上的正常表達(dá)）。
通過(guò)對(duì)睪丸組織的切片進(jìn)行掃描電鏡的分析，發(fā)現(xiàn)Clpp或Clpx敲除后的生殖細(xì)胞中，線粒體已經(jīng)不能夠行成長(zhǎng)條形的處于激活期線粒體的形態(tài)，而是多為圓形的，內(nèi)外膜出現(xiàn)嚴(yán)重形態(tài)紊亂的線粒體分布。ClpX敲除組中，線粒體呈現(xiàn)出空泡狀的結(jié)構(gòu)，可能引起了一定程度的線粒體自噬反應(yīng)。
通過(guò)JC-1染色去測(cè)試線粒體膜電位，以及細(xì)胞ROS水平恢復(fù)情況試驗(yàn)可以觀測(cè)出，與對(duì)照組精母細(xì)胞相比，ClpP或者ClpX敲除后的精母細(xì)胞中，線粒體膜電位及線粒體功能已經(jīng)出現(xiàn)紊亂。
線粒體功能的減弱進(jìn)而導(dǎo)致生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂中供能不足，致使減數(shù)分裂的一些微活動(dòng)進(jìn)程受阻，表現(xiàn)為染色體端粒脫離核膜，alpha-tubulin微絲蛋白表達(dá)異常等。這也進(jìn)一步導(dǎo)致這些線粒體受損的生殖細(xì)胞走向凋亡。
之后，該研究團(tuán)隊(duì)將睪丸組織細(xì)胞裂解成單細(xì)胞后，利用BSA梯度密度沉降的方法，將處于pachytene時(shí)期的生殖細(xì)胞分離出來(lái)，按組別送了RNA-seq以及m6A-seq，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和甲基化測(cè)序相互聯(lián)動(dòng)分析，發(fā)現(xiàn)代謝類的通路及mTOR通路變化最為顯著。將這些分離出的細(xì)胞進(jìn)行western blot分析，發(fā)現(xiàn)mTORC1信號(hào)的兩大底物，p70 S6K和S6均發(fā)生過(guò)度的磷酸化激活，表示mTORC1通路在ClpP或ClpX敲除的生殖細(xì)胞中出現(xiàn)過(guò)度激活。
在敲除組的小鼠中，利用in vivo注射雷帕霉素的方式，從出生后2周開(kāi)始藥物注射治療，每間隔一天注射一次，注射兩周后發(fā)現(xiàn)能夠成功抑制cKO動(dòng)物生殖細(xì)胞中的mTORC1通路, 利用生理學(xué)切片染色觀查發(fā)現(xiàn)，出生后一個(gè)月的小鼠testis組織中甚至可以觀測(cè)到處于減數(shù)分裂后期的圓形精細(xì)胞以及條形精細(xì)胞，表示該方法能夠起到部分挽救效果，通過(guò)調(diào)控mTORC1通路的磷酸化水平，從而去幫助恢復(fù)減數(shù)分裂的進(jìn)行及精子發(fā)生進(jìn)程。
綜上所述，該研究利用構(gòu)建條件性敲除的小鼠模型，充分展示了ClpP和ClpX在精子發(fā)生進(jìn)程中的重要性，這一對(duì)復(fù)合體蛋白對(duì)維持雄性生殖細(xì)胞中正常的線粒體形態(tài)和功能至關(guān)重要。ClpP 或ClpX 缺陷小鼠生精過(guò)程出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致不育。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)及甲基化測(cè)序分析，該項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了ClpP或ClpX的缺失會(huì)引起mTORC1通路的過(guò)度激活，為研究線粒體質(zhì)量調(diào)控基因在精子發(fā)生中的作用提供了新的證據(jù)和見(jiàn)解。
香港大學(xué)深圳醫(yī)院博士后郭晨曦為該項(xiàng)研究的第一作者及共同通訊作者，香港大學(xué)深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科副顧問(wèn)醫(yī)生、副研究員王天任為該項(xiàng)研究的通訊作者，該研究獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金，深圳市孔雀團(tuán)隊(duì)基金，深圳市科技創(chuàng)新基金等項(xiàng)目的支持。
通訊作者簡(jiǎn)介：王天任，現(xiàn)任香港大學(xué)深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心副顧問(wèn)醫(yī)師，副研究員，香港大學(xué)榮譽(yù)助理教授，博士后聯(lián)合培養(yǎng)導(dǎo)師，深圳市海外高層次人才。研究方向：卵巢老化、早衰，胚胎發(fā)育，女性生育力保存。畢業(yè)于北京大學(xué)，隨后在美國(guó)耶魯大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)中心完成博士后研究。從事生殖內(nèi)分泌和人類輔助生殖技術(shù)醫(yī)療和科研工作多年，研究方向?yàn)榫€粒體及卵巢老化、女性生育力保存和胚胎著床后發(fā)育等，相關(guān)研究承擔(dān)2項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金，發(fā)表SCI論著20余篇。
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